Des souris KO

Jean-François BOUHOURS, directeur de recherche émérite à l’Inserm, IFR 26 (Inserm/Université de Nantes)

En 2007, le prix Nobel de médecine a été attribué à trois chercheurs pour la découverte des cellules souches embryonnaires (CSE) de souris (Martin Evans) et pour la mise au point de techniques de modification ciblée de certains gènes (Mario Capecchi et Oliver Smithies).

Une modification ciblée consiste à modifier un gène porté par un chromosome en échangeant tout ou partie de ce gène par un segment d’ADN modifié, introduit au préalable dans le noyau d’une cellule. Elle utilise les mécanismes qui interviennent naturellement pour réparer l’ADN ou pour réaliser les recombinaisons entre chromosomes homologues au moment de la méiose.

Ces avancées permettent de réparer un gène défectueux ou d’inactiver un gène fonctionnel afin de préciser sa (ou ses) fonction(s). Lorsqu’un allèle inactivé est introduit à la place de l’allèle normal dans des CSE et que les CSE donnent naissance à des souris, on obtient des « souris KO » (Knock-Out) dont toutes les cellules sont incapables de produire la protéine codée par le gène ciblé.

Les souris KO ont été et sont encore d’une grande utilité pour connaître le rôle des gènes au cours de l’embryogenèse, de la vie adulte ou de la vieillesse, ou encore pour constituer des modèles d’étude de maladies (humaines, dans leur très grande majorité) afin de concevoir et tester des médicaments.

A bon rat, bon virus ?

Maude FLAGEUL, doctorante de l’unité « Biothérapies hépatiques » (Inserm/Université de Nantes)

La maladie de Crigler-Najjar de type 1 (CN-1) est une pathologie héréditaire récessive rare (elle touche un nouveauné sur un million) due à un déficit total en bilirubine glucuronosyltransférase (UGT1A1), une enzyme du foie. L’absence de UGT1A1 entraîne l’accumulation toxique de bilirubine dans le sérum et les tissus, source de troubles neuromusculaires et de retards mentaux. Les traitements actuels sont la photothérapie (exposition à la lumière) et la transplantation hépatique.

CN-1 est une bonne candidate pour un traitement par thérapie génique parce qu’un seul gène, qui code une protéine unique (UGT1A1), en est responsable et qu’il en existe un modèle animal, le rat Gunn, une espèce naturellement porteuse de la même mutation que celle des malades humains.

Des études précliniques, consistant à transférer chez des rats malades une copie du gène normal dans les noyaux de leurs cellules hépatiques à l’aide de virus de types divers, ont permis de les guérir. Une stratégie privilégiée consiste à utiliser des virus adéno-associés (AAV) notamment parce que ces vecteurs sont capables de transduire (modifier via la pénétration de leur génome) aussi bien des cellules en division, abondantes essentiellement chez les individus jeunes, que des cellules quiescentes. Ces AAV sont issus de virus non pathogènes(1) ; leur génome est modifié afin que leurs gènes ne s’intègrent pas parmi ceux des cellules hôtes. L’équipe néerlandaise de Piter Bosma, avec laquelle nous collaborons, a guéri efficacement et à long terme des rats Gunn adultes au moyen d’AAV modifiés. Nous avons testé son protocole chez l’animal âgé de 2 ou 14 jours en vue de son application au traitement de très jeunes patients. Une baisse importante du taux de bilirubine s’est effectivement manifestée chez les ratons traités mais s’est révélée peu durable.

Une formation de petits amas de cellules durablement « corrigées » a pourtant été observée. Ce constat nous a conduit à soupçonner puis à confirmer l’existence d’un phénomène inattendu d’insertion des gènes viraux dans le génome de ces cellules. Cette intégration, observée chez les jeunes rats (mais, à notre connaissance, pas chez des rats adultes), est indésirable car source potentielle d’effets pathogènes difficiles à contrôler. Aussi de nouvelles études sont-elles nécessaires afin de la comprendre et d’en évaluer les risques. Les perspectives de thérapie génique contre CN-1 et des pathologies similaires restent donc plus prometteuses pour les patients adultes que pour les très jeunes patients, mais rien n’est définitif.

Rat Gunn nouveau-né sain entre deux congénères malades, reconnaissables à leur ictère (jaunisse) © U948 (Inserm/Université de Nantes)
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(1) cf. "Détournements de virus et Les chiens de l’espoir", dans Têtes chercheuses n°3

Association française de Crigler-Najjar

« La maladie de Criger-Najjar » Document réalisé par le Professeur Labrune pour Orphanet, site consacré aux maladies rares et aux médicaments orphelins :

Pour les chercheurs et les étudiants :

Transient expression of genes delivered to newborn rat liver using recombinant adeno-associated virus 2/8 vectors. Flageul M, Aubert D, Pichard V, Nguyen TH, Nowrouzi A, Schmidt M, Ferry N. J Gene Med. 2009

DOSSIER
Le jardin des gènes

Recherche médicale

Des sésames de survie

La transgenèse animale permet d’explorer de nouvelles voies
thérapeutiques, notamment celles de transplantations durables.
par Carole GUILLONNEAU et Ignacio ANEGON, respectivement Docteur et directeur de recherche Inserm, chercheurs au Laboratoire de recherche en transplantation rénale, cardiaque et neuronale (Inserm/Université de Nantes). www.ifr26.nantes.inserm.fr/ITERT
Micro-injection d’ADN dans un embryon de rat réalisée sur le site de la plateforme « Rats transgéniques » de Biogenouest à Nantes © ITERT / Joëlle Veziers

La réussite d’une allogreffe, greffe d’un organe dont le donneur possède un système immunitaire incompatible avec celui du receveur, nécessite aujourd’hui l’administration de drogues immunosuppressives. Hélas, ces dernières affaiblissent fortement l’ensemble du système immunitaire de la personne greffée, entraînant des effets secondaires parfois très graves : cancers, infections aiguës... De plus, elles n’empêchent pas toujours la perte du greffon (l’organe transplanté) même dix ans après son implantation. Il semble donc opportun d’explorer des stratégies de modification génétique entraînant une suppression ou une réduction mieux ciblée et définitive de l’incompatibilité entre le greffon et l’organisme receveur.

Dépister des gènes d’intérêt

Les organismes expriment naturellement des substances immunosuppressives : celles-ci sont nécessaires pour stopper des réactions de défense devenues inutiles après une infection. Une équipe de notre laboratoire s’attache à identifier des gènes qui codent pour ces produits naturels. Elle développe dans le même temps des techniques permettant de transférer ces gènes via des vecteurs viraux (cf. "Naissance d'un génie" et "Des gènes sauteurs) afin de modifier les propriétés immunologiques d’organes transplantables tels que le coeur et rendre ainsi ces derniers résistants au rejet allogénique (réaction de l’organisme receveur).

Pour mieux connaître l’expression des molécules immunosuppressives et leur impact sur le greffon, nous avons expérimenté une transplantation cardiaque entre deux variétés de rat dont les antigènes tissulaires (des récepteurs cellulaires qui permettent le déclenchement d’une neutralisation des corps étrangers à l’organisme) ne sont pas compatibles. Le jour de la greffe, des vecteurs issus de virus de type adénovirus et dont les gènes codent pour les molécules immunosuppressives ont été injectés chez le rat receveur ; ils ont conduit à la survie définitive des greffons. Il est alors apparu crucial d’analyser finement les tissus des rats ainsi traités afin de dégager les facteurs propices au succès durable de l’opération. Nous avons notamment montré le rôle majeur, dans la survie des greffons, d’une population de lymphocytes T dits régulateurs. L’identification de cette population et l’emploi d’outils tels que les puces à ADN(1) nous ont permis de caractériser des gènes impliqués dans l’inhibition de la réponse immunitaire. Les fonctions de ces gènes sont alors étudiées plus précisément grâce à la mise au point de différents modèles animaux.

Produire des rats ad hoc

Ces modèles sont des rats génétiquement modifiés. Certains sont des rats transgéniques qui surexpriment les gènes ciblés dans leurs lymphocytes régulateurs (ils fabriquent davantage de molécules intéressantes qu’un rat normal) ; d’autres, qui sont produits dans notre unité de recherche grâce à la plateforme « Rats transgéniques » de Biogenouest (cf. "Science et biotechnologies en réseau"), sont des rats knock-out(2) (KO) : chez eux, un gène d’intérêt a été inactivé afin de mieux connaître son rôle en observant l’impact de l’absence de la ou des protéines qu’il code.

La production de ces différents rats s’est avérée difficile, soit parce que la technique de micro-injection d’ADN utilisée pour la transgenèse n’est pas assez efficace, soit parce qu’il est délicat d’obtenir des rats KO via la manipulation de cellules embryonnaires. Cependant, nous venons de réaliser des progrès importants. L’utilisation de vecteurs viraux de type lentivirus a accru l’efficacité de la transgenèse. Le recours à une technique nommée genome walking permet désormais de localiser les transgènes intégrés dans les cellules des rats. Enfin, l’utilisation de nucléases « en doigts de zinc », des enzymes capables d’extraire du génome la séquence d’ADN ciblée et elle seule, nous a permis de produire les rats KO souhaités.

Grâce à ces nouveaux modèles de rats, nous réalisons actuellement de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes immuns impliqués dans le rejet ou la survie d’allogreffes.

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• (1) dispositif d’analyse dont les différents réactifs contiennent des brins d’ADN connus et dont les réactions particulières avec des segments d’ADN à caractériser permettent d’identifier ces derniers visuellement. Cf.Le point sur les puces à ADN

• (2) cf. Des souris KO, Jean-François Bouhours

"L'Inserm de Nantes aidé par Ouest-Génopole"

PDF sur la technologie des puces à ADN

Des virus mutés à l'épreuve

Georges VASSAUX, directeur de recherche Inserm, chercheur à l’unité U948 « Biothérapies hépatiques », Institut des maladies de l’appareil digestif (Inserm/Inra/CHU de Nantes)

Un virus oncolytique est un virus génétiquement modifié qui n’est capable de se répliquer qu’après avoir infecté des cellules cancéreuses. Cette réplication (la multiplication des particules virales) aboutit à une lyse, c’est-à-dire à la destruction des cellules tumorales. L’infection de cellules saines par le virus reste possible mais n’est pas dangereuse (cf. schéma ci-dessous).

Un projet développé par notre unité de recherche consiste à utiliser ce type de virus pour détruire des cancers primaires du foie, une pathologie qui reste réfractaire à la plupart des traitements classiques et à laquelle correspond une très forte mortalité. Comme il faut s’assurer de la propagation du virus thérapeutique et de sa réplication destructrice dans les seules cellules cancéreuses, il est crucial d’associer à cette stratégie une technologie permettant de suivre le devenir du virus après son administration à des patients. Nous avons donc développé une méthodologie qui intègre une technique d’imagerie médicale spécifique et qui est d’abord testée chez un sujet sain.

Un gène, qualifié de « rapporteur » et nommé Na/I symporteur (ou NIS), est inséré préalablement dans le génome du virus oncolytique(1). Une telle opération est réalisée parce que les protéines pour lesquelles code ce gène font augmenter la concentration d’iode dans les cellules qui l’expriment. Après administration du virus modifié, il suffit d’anesthésier le sujet, de lui injecter une faible quantité d’iode radioactif et de le placer dans le champ d’une caméra qui va détecter la distribution spatiale du radio-isotope injecté(2). On détermine alors la localisation anatomique des particules virales, ce qui va permettre d’en vérifier l’efficacité chez le sujet malade : une forte concentration d’iode dans les tumeurs témoigne en effet d’une réplication massive.

Ce procédé est potentiellement très utile à la sécurité des thérapies géniques car il peut offrir un moyen relativement simple de surveiller la dissémination des vecteurs viraux.

Nous sommes actuellement en fin de validation de la méthodologie dans des modèles animaux (souris) de cancers hépatiques et nous projetons de démarrer très bientôt des essais cliniques chez des patients •

© RC2C, d’après G. Vassaux
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(1) opération réalisée au Laboratoire de thérapie génique (Inserm/Université de Nantes)

(2) cf. "Lumières médicales", Têtes chercheuses n°5

Préserver les neurones

Des souris transgéniques aident à lutter contre les maladies neurodégénératives
par Joël EYER, chargé de recherche Inserm, directeur du laboratoire « Neurobiologie et transgenèse » (Université et CHU d’Angers)

Le neurone, cellule de base du système nerveux, possède une morphologie très particulière avec son axone pouvant atteindre 1,5 m de long chez l’Homme et dans lequel circulent des protéines nécessaires à la conduction électrique de l’influx nerveux. Ces protéines sont synthétisées dans le corps cellulaire qui contient le noyau, puis transportées dans l’axone à une vitesse de 1 à 400 mm par jour (contre près de 100 m par seconde pour les influx nerveux).

Le bon fonctionnement des neurones dépend étroitement de l’activité des neurofilaments, protéines essentielles à la structuration du neurone et au transport des produits. Dans plusieurs maladies neurodégénératives (maladies d’Alzheimer, de Parkinson ou SLA, sclérose latérale amyotrophique), ce trafic est perturbé au point de provoquer la mort du neurone. Dans la sclérose en plaques, c’est la couche de myéline entourant l’axone qui est détruite ; la conduction nerveuse est alors bloquée, mettant également en jeu la survie du neurone.

Des embouteillages de filaments

Ces pathologies sont graves parce que les neurones morts ne sont pas remplacés. De plus, le système nerveux est entouré d’une barrière biologique protectrice qui rend difficile le passage et donc l’efficacité des médicaments. Pour préserver les neurones, un axe de recherche vise à comprendre comment leurs altérations se produisent. Il recourt à des modèles animaux qui présentent des altérations similaires à celles observées chez l’Homme, naturelles ou induites expérimentalement (par intoxication, lésion ou transgenèse). D’autres recherches consistent à trouver de nouvelles molécules capables d’empêcher la mort neuronale et les moyens de les introduire dans les neurones.

Dans l’un des modèles étudiés au sein de notre laboratoire, les neurones de souris transgéniques expriment une forme altérée des neurofilaments, notée NFH-LacZ. Ces derniers s’accumulent de façon anormale en certains endroits, empêchant le transport efficace de différents produits cellulaires. Le modèle sert à mieux connaître les conséquences du phénomène d’agrégation observé dans les maladies d’Alzheimer, de Parkinson et la SLA, ainsi que pour tester de nouvelles substances capables de prévenir cette agrégation.

Il s’agit en particulier de comprendre pourquoi la mutation d’un gène impliqué dans la synthèse des neurofilaments et exprimé dans tous les neurones provoque la dégénérescence d’une seule population de neurones. Ce type de problème s’avère très complexe ; les progrès se font pas à pas en accumulant diverses observations. à titre d’exemple, dans la SLA, les motoneurones (qui commandent l’activité musculaire) de la moelle épinière sont les principales cibles de l’accumulation des neurofilaments provoquée par l’expression d’une enzyme, la superoxyde dismutase (SOD). En croisant notre souris NFH-LacZ avec des souris transgéniques qui expriment la SOD humaine, nous avons montré que la plupart des neurones détruits sont ceux où l’agrégation des neurofilaments s’effectue conjointement à celle de mitochondries, des organites responsables du métabolisme énergétique du neurone.

Des transgenèses pour voir

Nous avons par ailleurs éclairé l’implication de la protéine STOP identifiée il y a quelques années par une équipe de l’Institut des neurosciences de Grenoble : cette protéine s’agrège également avec les neurofilaments, aussi bien dans le modèle NFH-LacZ que dans les motoneurones de patients atteints de SLA. Les études menées en parallèle sur les patients humains et sur les modèles animaux transgéniques permettent de préciser les interactions de cette protéine avec les neurofilaments et les effets de ces interactions. Nous cherchons aussi à savoir si des dysfonctionnements observés sont dus à des protéines STOP mutées. Enfin, il s’agit d’expliquer comment des facteurs environnementaux ou le vieillissement des individus accentuent les anomalies. Pour cela, de nouveaux modèles d’animaux transgéniques, produits notamment par notre équipe, expriment des neurofilaments fluorescents. Cette propriété permet d’observer le mouvement des filaments en direct sur l’animal vivant. Elle offre ainsi un moyen inégalé de compréhension des mécanismes d’altération de ce mouvement et d’évaluation de l’efficacité de nouveaux médicaments potentiels

La coloration en rouge des microtubules qui remplissent ces neurones d’hippocampe de souris permet de visualiser la structure de ces derniers, particulièrement affectés par la maladie de Parkinson ou son équivalent chez la souris. En bleu apparaissent les noyaux des neurones et d’autres cellules comme les astrocytes © LNBT / Julien Balzeau

Une affaire de coeur

Différentes méthodes du génie génétique sont associées en vue de dépister, prévenir et traiter des pathologies telles que la maladie cardiaque de Lenègre.
par Flavien CHARPENTIER et Jean-Jacques SCHOTT, directeurs de recherche Inserm, Institut du thorax et Institut de recherche thérapeutique (Inserm/Université de Nantes), équipe « Cardiopathies et mort subite » (CNRS)

La maladie de Lenègre est une pathologie relativement fréquente. Elle est caractérisée par des troubles progressifs de la conduction de l’influx électrique cardiaque au cours du vieillissement. Ces troubles se manifestent par une dégénérescence de cellules spécifiques, et principalement celles qui constituent le faisceau de His (cette structure connecte différentes parties du coeur entre elles pour synchroniser les contractions des ventricules et celles des oreillettes). Le seul traitement actuel est l’implantation d’un stimulateur cardiaque (pacemaker) électronique quand la conduction devient trop altérée pour permettre des contractions normales.

En 1963, Jean Lenègre a proposé qu’il s’agisse d’une maladie dégénérative affectant, sous forme de fibrose (déstructuration), le tissu cellulaire de conduction cardiaque. Il restait à en trouver l’origine.

Des mutations dépistées

En 1999, nous avons repéré un ensemble de personnes appartenant à une grande famille de la région nantaise et présentant lesdits troubles. Une analyse des génomes de ces personnes nous a conduit à relever la présence, chez chacune d’entre elles, d’une mutation du gène SCN5A. Ce gène code Nav1.5, une « protéine-canal » qui a pour fonction de transporter du sodium à travers la membrane plasmique des cellules cardiaques. La mutation conduit à une altération de Nav1.5 et à la perte totale de sa fonction. La maladie se transmet selon un mode autosomique dominant : les patients possèdent un allèle sain et un allèle muté sur un chromosome non sexuel et présentent, à cause de cette anomalie, une diminution de 50 % du courant de sodium transporté par Nav1.5.

Depuis lors, d’autres mutations de SCN5A ont été identifiées par différentes équipes de recherche, mais aucune étude n’a permis de comprendre pourquoi la perte de fonction de Nav1.5 est sans conséquence majeure chez les jeunes et ne conduit à une pathologie sévère qu’au cours du vieillissement.

Nous avons alors entrepris de travailler sur un modèle de souris transgénique, dont un allèle du gène Scn5a (l’équivalent de SCN5A chez l’Homme) a été invalidé (muté). Le modèle s’est révélé satisfaisant : les souris étudiées présentent également une réduction de 50 % de leur courant sodique cardiaque ainsi qu’une détérioration progressive de la conduction avec le vieillissement, et nous avons montré que cette altération est due à une fibrose qui s’accentue avec l’âge. Nos résultats suggèrent que la maladie de Lenègre découlerait, premièrement, du dysfonctionnement de Nav1.5 et, secondairement, de l’apparition de fibrose.

Des cellules transformées en pacemakers

Ce modèle va permettre de tester l’efficacité de médicaments susceptibles d’empêcher le développement de la fibrose, afin de proposer une thérapie préventive aux personnes porteuses de SCN5A muté.

En parallèle, nous menons des travaux visant à mettre au point une thérapie génique. Il s’agit de développer des pacemakers biologiques comme alternative aux pacemakers électroniques, plus pratique et plus sûre. Notre approche consiste à injecter directement dans le coeur, au niveau du faisceau de His, des gènes exprimant des protéines qui vont pallier le manque de Nav1.5 en transformant certaines cellules cardiaques en cellules pacemakers. Afin que ces gènes puissent s’insérer dans les noyaux des cellules ciblées, nous travaillons à la mise au point de vecteurs non pas d’origine virale mais synthétiques (des microcapsules de polymères). Nous venons de démontrer la faisabilité de notre méthode chez la souris.

Enfin, si le rôle de SCN5A dans la maladie de Lenègre est aujourd’hui établi, l’élucidation de tous les facteurs de cette pathologie n’est pas terminée.

Réseau de conduction de l’influx électrique cardiaque. Au centre, les cellules du faisceau de His assurent la conduction des oreillettes aux ventricules de telle sorte que ces derniers se contractent de façon synchrone et juste après la contraction des oreillettes. © RC2C. Source : www.prevention.ch/lesstimulateurscardiaques.htm

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